Поляризационно-интерференционный микроскоп BIOLAR
(Техническое описание и инструкция по эксплуатации)

← Ранее: Раздел 8. Измерение светопропускания.

Далее: Раздел 10. Укомплектование микроскопа Biolar →

Раздел 9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУХИХ ВЕЩЕСТВ КЛЕТОК

Приниманем, что биологическую клетку можно рассматривать как однородную плитку с толщиной t (рис. 30), погруженную в водяной среде. В таком случае, разность оптического пути Фw между светом, проходящим через клетку и светом, проходящим мимо неё, равна Ф_w = (n_w—n)t  (37), где n является коэффициентом преломления внутриклеточного вещества, nw — коэффициентом преломления воды.

С другой стороны, между коэффициентом преломления nw. растворителя (в данном случае воды) и концентрацией с, выраженной количеством m граммов вещества, растворенного в 100 миллилитрах раствора, существует зависимость: n — nw = δ×с   (38).

Коэффициент δ, называемый удельным приростом коэффициента преломления (по англ. "specific refractive increment"), для большинства биологических веществ равен 0,0018.

Концентрация c в соответствии с вышеподанным определением может выть представлена так: c = (100 m) / (A t)  (39), где А является поверхностью проекции клетки в плоскости, перпендикулярной к направлению прохождения света через клетку.

Из вышеописанных трех зависимостей получаем следующее выражение для количества граммов m сухих веществ находящихся в клетке: m = (Фw A) / (100 δ):

Следовательно, измеряя разность оптического пути Фw. вышеописанным способом (в однородном интерференционном поле с большим раздвоением изображения или в поле интерференционных полос) и зная из планиметрических измерений величины поверхности А клетки, можно непосредственно из формулы (40) определить полное количество граммов сухих веществ, находящихся в клетке, погруженной в водяной среде.

В случае, если исследуемый биологический объект является в большой степени неоднородным и в разных местах дает разные фазовые смещения, то полное содержание сухих веществ вычисляется путем суммирования парциальных содержаний, в определенных отдельных фрагментах, которые могут считаться почти однородными.

Во многих случаях, особенно при сравнительных исследованиях, достаточно знать количество сухих веществ приходящихся на единицу поверхности:

В таком случае измерение сводится к измерению разности оптического пути Фw. Зная содержание сухих веществ на единицу поверхности и толщину клетки, можно определить концентрацию с находящегося в ней вещества:

C = m'/t = Фw / (100 δ t)   (42)

Толщину клетки или иного биологического объекта можно определить, между прочим, вышеописанным способом (раздел 6), применяя метод двойной иммерсии или двух длин световых волн. Формулы (40), (41) и (42) правильны только в отношении биологических объектов, погруженных в водяной среде. В случае, когда клетка находится в другой, чем вода среде, причем эта среда не проникает в клетку, то количество сухих веществ следует вычислять по формуле:

где Фs является разностью оптического пути клетки относительно к среде, ns — коэффициентом преломления этой среды.

Следовательно, для определения содержания сухих веществ в клетке, помещенной в неводяной среде, необходимо знать толщину клетки t. Если однако коэффициент преломления ns иммерсионной среды отличается только в незначительной степени от коэффициента преломления воды nw, то второй член вышеуказанной формулы ничтожно мал по сравнению с первым членом и в этом случае в качестве толщины t клетки достаточно принять оценочное значение, определенное приблизительными методами (например, путем измерения диаметра клетки, если она имеет более или менее шарообразную форму).

Дело обстоит немного иначе, если среда проникает в клетку. В этом случае клетку можно рассматривать как совокупность частиц цитоплазмы, равномерно распределенных в некотором замкнутом пространстве, через которое проникает среда (рис. 41а). Разность оптического пути Фs, вызванная целой клеткой, является в таком случае эквивалентной разности оптического пути, которая была бы вызвана тонким слоем тесно "упакованных" частиц, цитоплазмы (рис. 41b), имеющим такую же поверхность А, какую имеет клетка.

Пусть n_c будет коэффициентом преломления частиц цитоплазмы, n_s — коэффициентом преломления иммерсионной среды, t — геометрической толщиной клетки, f — частью объема клетки, незанятой частицами цитоплазмы. Если из иммерсионной среды в клетку проникает только вода, то в таком случае разность оптического пути Фs, вызванная клеткой, по отношению к среде s будет равна: Фs=(nc—ns)t(1—f)—(ns—nw)tf (44)

а формула (38) в этих условиях будет иметь следующий вид: nc-nw=dc=d 100m/At(1-f) (45)

Соединяя уравнения (44) и (45), получаем следующее выражение для содержания сухих веществ в клетке, в которую из среды проникает вода [46]:

Наоборот, если в клетку проникает вся иммерсионная среда (как вода, так и растворенные в ней вещества), то в таком случае разность оптического пути Фs будет равна [47]:

а для сухих веществ получаем выражение [48]:

Как видно, для определения сухих веществ клетки, в которую проникает среда, необходимо знать "эффективную" толщину клетки t'=(1 — f)t. Её можно определить также методом двойной иммерсии.

Для определения сухих веществ клетки, в которую из иммерсионной среды проникает только вода, необходимой является кроме того геометрическая толщина t клетки. Для измерений разности оптического пути клеток и иных биологических объектов можно применять как метод интерференционных полос (призма № 2), так и метод однородного поля с большим раздвоением изображения (призма № 3). Выбор одного или другого метода зависит главным образом от величины исследуемого объекта, желательного раздвоения изображения и конкретных экспериментальных условий. Могут при этом иметь место два случая:

COLOR!

а) изображения (обыкновенное и необыкновенное) клетки совершенно разделены (рис. 42),

б) изображения клетки частично разделены (рис. 43).

В первом случае разность оптического пути клетки Ф3 по отношению к иммерсионной среде можно измерить в каждой точке клетки: напротив, во втором случае — только в тех областях, где изображения не находят на себя.

Однако, если имеем дело с клетками, содержащими ядра, то в случае частичного раздвоения изображения клетки можно произвести измерение разности оптического пути самого ядра по отношению к цитоплазме. Величину раздвоения следует при этом подобрать так, чтобы только изображения ядер выли раздвоены и чтобы они не выходили за пределы общей области изображения клетки (рис. 43).

Наоборот, при полном разделении изображений клетки (рис. 42), в области ядра будет измеряться разность оптического пути ядра по отношению к окружающей клетку среде, однако вместе с цитоплазмой, находящейся над и под ядром, что необходимо учесть при определении сухих веществ ядра.

Пусть Ф1 будет разностью оптического пути между цитоплазмой Ct в непосредственной близости ядра и окружающей клетку средой (рис. 44); Ф2 — разностью оптического пути между ядром J, в его центральной области вместе с находящейся под ним и над ним цитоплазмой, и окружающей средой; Ф3 — разностью оптического пути между самым ядром J и цитоплазмой Ct, окружающей ядро. Если не брать во внимание возможной разницы толщины клетки в месте измерения разностей оптических путей Ф1, и Ф2, правильной является следующая зависимость между Ф1, Ф2 и Ф3: Ф2 = Ф1 + Ф3 (49).

Следовательно, измеряя Ф1 и Ф3 одновременно получаем Ф2 или измеряя Ф1 и Ф2 получаем Ф3.

Приведенные здесь общие положения по измерению сухих веществ, коэффициента преломления и толщины клетки, имеют целью только ориентировку читателя в данном вопросе и не могут считаться достаточными. Более точные подробности и практические указания можно найти в литературе, список которой помещен в конце этого описания.

Измерения сухих веществ коэффициента преломления и толщины клеток конечно не исчерпывают всех возможностей микроскопа BIOLAR PI при выполнении измерений в биологических и медицинских исследованиях. Существует целый ряд иных возможностей, как например, измерение светопропускания абсорбционных микрообъектов, измерение градиента разности оптического пути и иных величин, исследования поверхностных явлений и явлений напряжения, измерение диффузии, исследование осмотических реакций, измерение фермы топографии разных объектов и т.д.

Кроме того, поляризационно-интерференционный микроскоп BIOLAR PI дает много интересных и новых возможностей в отношении качественных исследований и наблюдений благодаря, главным образом, его большой пластичности и верности отображения интерференционного изображения (особенно дифференциального), регулировке цветового контраста, возможности плавного перехода от цветового контраста к темному и светлому полю, большой чувствительности примененных в этом микроскопе интерференционных методов, а также возможности наблюдения и исследований как амплитудных так и фазовых объектов.

 

← Ранее: Раздел 8. Измерение светопропускания.

Далее: Раздел 10. Укомплектование микроскопа Biolar →