Студенческая научная лаборатория кафедры гистологии ДГМА - Лабораториум
 home главная · контакты · форум · книги  
    

Поляризационно-интерференционный микроскоп BIOLAR
(Техническое описание и инструкция по эксплуатации)

← Ранее: Раздел 5. Измерение разности оптического пути. Далее: Раздел 7. Измерение двупреломления

Раздел 6. ИЗМЕРЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА ПРЕЛОМЛЕНИЯ И ТОЛЩИНЫ

  1. Оценка величины коэффициента преломления по отношению к среде
  2. Оценка микронеровности поверхности
  3. Измерение коэффициента преломления и толщины с применением. Метода интерференционных полос и однородного цвета с большим раздвоением изображения (призмы № 2 и № 3)
  4. Измерение коэффициента преломления по методу дифференциальной интерференции (призма № 1)
  5. Измерение коэффициента преломления методом дифференциональной интерференции с полем интерференционных полос (призма № 2)

1. ОЦЕНКА ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА ПРЕЛОМЛЕНИЯ ПО ОТНОШЕНИЮ К СРЕДЕ

рис.30

Предположим, что исследуемый объект В (рис. 30) с неизвестным коэффициентом преломления n находится в иммерсионной среде с известным коэффициентом преломления n1. Желая определить коэффициент преломления n, необходимо сначала установить, является ли он большим или меньшим, чем коэсрфициент преломления n1 окружающей иммерсионной среды J. В фазово-контрастном микроскопе эта задача решается моментально; наоборот, в случае интерференционного микроскопа ответ не является немедленным и требует некоторого анализа изменения интерференционной окраски или направления отклонения интерференционных полос. Такой анализ наиболее удобно производить в однородном темном цвете или при помощи темной полосы нулевого порядка интерференции.

1.1. Дифференциальный метод (призма № 1).

Изображение клеток дрожжей в водяной среде

Рис. 50. Изображение клеток дрожжей в водяной среде: a) в однородном серо-зеленом цвете; b) в однородном чувствительном цвете I порядка интерференции (двупреломляющая призма № I, иммерсионный объектив 100X); c) в обыкновенном микроскопе в светлом поле.

Отличительной чертой этого метода — как было упомянуто является то, что в изображении наблюдаемого объекта с изменяющейся толщиной почти всегда появляется такое место (или несколько мест), в котором окраска такая же самая как окраска фона (смотри, например, рис. 47 и 50). Особенно сильно выступает это при установке двупреломляющей призмы на окраску фона поля зрения микроскопа. При перемещении двупреломляющей призмы в поперечном направлении тёмный цвет в изображении наблюдаемого объекта тоже будет перемещаться. Направление перемещения этого цвета отвечает или не отвечает направлению передвижения призмы, что зависит от того, является ли коэффициент преломления n исследуемого объкта меньшим или большим, чем показатель преломления n1 окружающей среды. В случае, если направление перемещения темного цвета в изображении исследуемого объекта отвечает направлению передвижения двупреломляющей призмы (установленной первоначально на тёмный фон поля зрения), то коэффициент преломления n этого объекта больше, чем коэффициент преломления n1 окружающей среды. Напротив, если направление перемещения тёмного цвета в изображении обратно направлению передвижения двупреломляющей призмы, то коэффициент преломления n исследуемого объекта меньше коэффициента преломления n1 окружающей среды.

1.2. Метод однородного цвета с большим раздвоением изображения (призма № 3).

При этом методе, в качестве отличительной черты для оценки величины коэффициента преломления исследуемого объекта лучше всего принять последовательность затемнения раздвоенных изображений при передвижении двупреломляющей призмы в поперечном направлении. Если при этом последовательность затемнения изображений темным цветом нулевого порядка интерференции отвечает направлению передвижения двупреломляющей призмы, то коэффициент преломления n исследуемого объекта больше коеффициента преломления n1 окружающей среды — и наоборот, если последовательность затемнения изображений этим цветом обратна направлению передвижения призмы, то коэффициент преломления n меньше n1.

1.3. Метод интерференционных полос (призма № 2).

Перемещая двупреломляющую призму, наблюдаем, с которой стороны темной полосы нулевого порядка интерференции получается затемнение одного или другого изображения исследуемого объекта. Если при этом левое изображение затемняется с правой стороны этой полосы, а правое изображение с левой, то коэффициент преломления n исследуемого объекта больше коэффициента преломления n1 окружающей среды, — и наоборот, если левое изображение затемняется с левой стороны нулевой темной полосы, а правое изображение с правой стороны этой полосы, то коэффициент преломления n меньше n1.

Все вышерассмотреные случаи приведены в табл. III, на основании которой можно оценить, является ли коэффициент преломления исследуемного объекта большим или меньшим, чем коэффициент преломления окружающей среды.

2. ОЦЕНКА МИКРОНЕРОВНОСТИ ПОВЕРХНОСТИ

Допустим, что имеем празрачую плитку и что на её поверхности находится микроскопическая неровность. Мы хотим установить, является ли она углублением или выпуклостью.

На основании самого только качественного наблюдения микроскопного изображения нельзя сказать ничего совершенно верного, так как часто случается, что та же самая деталь один раз кажется холмиком, а через мгновение долиной и, кроме того, в одном интерференционном цвете она кажется холмиком, а в другом долиной. Однако интерференционные методы позволяют без всяких сомнений установить, с какого рода неровностью мы имеем дело. Нужно однако знать, является ли коэффициент преломления n плитки, на которой находится неровность, большим или меньшим, чем коэффициент преломления n1 среды, находящейся над плиткой. При выполнении этого условия, наблюдая направление перемещения тёмного цвета в изображении исследуемой детали (дифференциальный метод) или последовательность затемнения раздвоенных изображений (метод однородного цвета с большим раздвоением изображения и метод полос), можно проверить аналогичным образом, как прежде в случае оценки величины показателя преломления, с какого рода микронеровностями мы имеем дело. Отдельные варианты для каждого метода приведены в табл. III.

3. ИЗМЕРЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА ПРЕЛОМЛЕНИЯ И ТОЛЩИНЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫХ ПОЛОС И ОДНОРОДНОГО ЦВЕТА С БОЛЬШИМ РАЗДВОЕНИЕМ ИЗОБРАЖЕНИЯ (ПРИЗМЫ № 2 И №3)

Измеряя вышеописанным способом разность оптического пути Ф исследуемого объекта по отношению к окружающей среде с известным коэффициентом преломления n1, можно затем определить по формуле: Ф = (n1—n)t   (22).

рис.30

Коеффициент преломления n исследуемого объекта, при условии, что известна его толщина t, или наоборот — толщины t, если известен коэффициент преломления n (рис. 30), причем для n < n1, берется Ф со знаком "+" а для n > n1, со знаком "—". Следовательно, чтобы не совершить ошибки, необходимо сначала точно установить, описанным прежде способом, является ли коэффициент преломления n исследуемого объекта больше (n > n1) или меньше (n < n1) коэффициента преломления n1 окружающей среды. В случае, если измерение разности оптического пути будет выполнено в двух иммерсионных средах, например, в воздухе и в воде (или в воде и иной жидкости), коэффициенты преломления которых n1 и n2 известны, то можно одновременно определить как коэффициент преломления n исследуемого объекта, так и его толщину t. В этом случае получаем два уравнения:

Ф1 = (n1 — n) t   Ф1 = (n2 — n) t   (23),   из которых определяем n и t:

n = (Ф1n2-Ф2n1) / (Ф1-Ф2)   t = (Ф1-Ф2) / (n1-n2)   (24)(25),

причем значение разности оптического пути Ф1 и Ф2 следует брать, соответственно, со знаком "+" или "—" по вышеприведенному правилу.

Метод двух иммерсий может быть применен только тогда, когда исследуемый объект ведет себя одинаково, как в одной так и в другой иммерсионной среде. Следовательно, иммерсионные жидкости должны быть так подобраны, чтобы толщина и коэффициент преломления исследуемого объекта не изменялись.

Иной метод одновременного измерения толщины и показателя преломления состоит в измерении разности оптического пути для двух длин волн λ1 и λ2 разнящихся между собой. Однако, этот метод может быть употреблен только в том случае, если иммерсионная среда характеризуется большой дисперсией коэффициента преломления, а исследуемый объект очень незначительной. В таком случае имеем два уравнения аналогичные уравнениям (23), в которых n1 и n2 являются известными коэффициентами преломления среды, соответственно для длины световой волны λ1 и λ2.

Такой жидкостью, имеющей большую дисперсию, является, например, коричное масло.

Ещё один метод одновременного измерения коэффициента преломления и толщины состоит в измерении разности оптического пути при двух разных температурах, при которых значительно изменяется коэффициент преломления среды, но не изменяется (или изменяется в незначительной степени) коэффициент преломления и толщины исследуемого объекта. Из формулы (22) следует, что если известны толщина t и коэффициент преломления n какого-нибудь эталонного объекта (например, тонкой и узкой стеклянной плитки), то может быть определен коэффициент преломления n1 любой иммерсионной жидкости.

4. ИЗМЕРЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА ПРЕЛОМЛЕНИЯ ПО МЕТОДУ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИИ (ПРИЗМА № 1)

рис.31

Возьмем во внимание какой-либо объект В, отличающий мягким падением разности оптического пути (рис. 31). Зная угол касания α в любой точке H этого объекта и измеряя вышеописанным способом разность оптического пути между интерференционными волнами в интерференционном изображении этой точки, можно затем определить коэффициент преломления n объекта В по формуле (13):

в которой n1 — известный коэффициент преломления окружающей среды, r — раздвоение изображения. В вышеприведенной формуле ψ принимается со знаком "+" для n1 > n и со знаком "—" для n1<n.

Если измерение разности оптического пути ψ в данной точке изображения исследуемого объекта будет произведено в двух разных иммерсионных средах с известными коэффициентами преломления n1 и n2, то можно одновременно определить угол касания α и коэффициент преломления n. В этом случае имеем два уравнения:

tg α

из которых определяем n:

n

а затем из одного из уравнений (26) угол а разность оптических путей ψ1 и ψ2 в формулах (26) и (27) следует принимать со знаком "+" или "—" (в соответствии с правилом, приведенным выше). Для достижения большей точности измерения коэффициента преломления n рекомендуется производить измерения в нескольких точках и брать среднее значение. Конечно, иммерсионные жидкости следует падбирать таким образом, чтобы исследуемый объект не изменял в этих жидкостях своих оптических и геометрических свойств.

Кроме метода двойной иммерсии можно также применять и в этом случае вышеоговоренные методы двух разных длин световых волн и двух разных температур.

Для измерений коэффициента преломления жидкости при помощи дифференциальной призмы (№ 1) предусмотрены специальные рефрактометрические сосуды, поставляемые по специальному заказу пользователя.

Сосуд для измерения коэффициента преломления жидкости методом дифференциальной интерференции

Рис. 32. Сосуд для измерения коэффициента преломления жидкости методом дифференциальной интерференции. — PR — рефрактометрическое стекло, РР — вспомагательное стекло, SP — микроскопное предметное стекло, SN — микроскопное покровное стекло, С — исследуемая жидкость.

Такой сосуд состоит из стеклянной плитки SP (рис. 32), к которой приклеена рефрактометрическая плитка PR с косым уступом, а также вспомогательная плитка PP. Между этими плитками находится узкий каналик, в котором помещается капля исследуемой жидкости С, прикрытая микроскопной прикрывающей плиткой SN.

Измеряя разность оптического пути в интерференционном изображении косого уступа рефрактометрической плитки, определяем коэффициент преломления n1, жидкости C по формуле:

где n является известным коэффициентом преломления рефрактометрической плитки PR, α — углом косого уступа этой плитки (а=45°), r — раздвоением изображения, зависимым от кратности увеличения объектива (смотри табл. II). Знак "+" в вышеподанной формуле относится к случаю, когда n1 > n, а знак "—" когда n1 < n.

Измерение производится при помощи объектива с кратностью увеличения 10 X.

Рис. 33. Поле зрения микроскопа при измерении коэффициента преломления при помощи рефрактометрического сосуда, представленного на рис. 32.

Рефрактометрические сосуды устанавливаются на микроскопном столике таким образом, чтобы верхняя грань уступа плитки PR находилась посередине поля зрения микроскопа и была направлена параллельно преломляющей грани двупреломляющей призмы. Тогда поле зрения микроскопа разделено на две разные части I и II (рис. 33) с разной окраской (при применении белого цвета) и с разной яркостью (при применении монохроматического света).

Измерение разности оптического пути ψ производится в однородном темпом цвете нулевого порядка интерференции, затемняя максимально сначала одну, а затем вторую половину поля зрения или приводя обе половины к одинаковой яркости. В первом случае разность оптического пути вычисляется по формуле:

а во втором, по формуле:

где р0 является нулевым положением двупреломляющей призмы, при котором достигается максимальное затемнение одной половины поля зрения, являющейся изображением рефрактометрической плитки за пределами уступа, p1 — положением призмы, при котором достигается максимальное затемнение второй половины поля зрения, являющейся изображением уступа, pr — положением, при котором обе половины поля зрения принимают одинаковую яркость.

измерение коэффициента преломления жидкости

Рис. 34. Способ измерения коэффициента преломления жидкости (при помощи рефрактометрического сосуда, представленного на рис. 32) методом дифференциальной интерференции

Установка обеих половин на одинаковую яркость возможна только лишь в том случае, если ψ меньше длины волны примененного света. Установка на максимальное затемнение одной, а затем второй половины поля зрения зависит от визуальной способности распознавания максимума зачернения. Более точной установки двупреломляющей призмы можно достигнуть, наблюдая дифференциальное изображение, появляющееся в срокалыюй плоскости изображения объектива. С этой целью, в место одного окуляра в бинокулярной насадке вставляется второй вспомогательный микроскоп, который срокусируется на выходном зрачке объектива, где видны оба изображения S0 и S1 (рис. 34) щели S (рис. 1). Перемещая двупреломляющую призму устанавливаем её так, чтобы через середину одного, а затем второго изображения щели проходила нулевая интерференционная полоса. Такая установка отвечает максимальному затемнению одной, а затем второй половины поля зрения и лишена неуверенности, которая выступает при оценке максимума зачернения. Установка нулевой интерференционной полосы точно в центре изображений S0 и S1 очень чувствительна и гарантирует установку двупреломляющей призмы с точностью 0,01 мм, что делает возможным производить измерение коэффициента преломления с точностью до 0,0001 мм. Расстояние "x" между изображениями щели S0 и S1 тем больше, чем больше разность между коэффициентами преломления исследуемой жидкости и рефрактометрической плитки. В случае, если эта разность незначительна, изображения S0 и S1 находят на себя и измерение при помощи этого метода делается невозможным.

Рефрактометрических сосуда — два. Они отличаются между собой только коэффициентом преломления n рефрактометрической плитки PR. Эти сосуды представляют собой комплект, посредством которого можно производить измерения коэффициента преломления в диапазоне 1,3—1,8.

5. ИЗМЕРЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА ПРЕЛОМЛЕНИЯ МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИОНАЛЬНОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИИ С ПОЛЕМ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫХ ПОЛОС (ПРИЗМА № 2)

Измерение коэффициента преломления жидкости методом дифференциональной интерференции с полем интерференционных полос (призма № 2) производится применяя вышеописанные рефрактометрические сосуды, коэффициент преломления жидкости определяется по формуле 28. Разность оптического пути выступающая в формуле 28, определяется по формуле 15, измеряя посредством окуляра 12x с микрометрической шкалой ширины полосы h (как описано в разделе 5) и перемещение d интерференционных полос (лучше всего нулевой полосы) в области косого среза.

При измерениях лучше всего применять объектив с увеличением 10 X.

Рефрактометрические сосуды устанавливаются на столике микроскопа таким образом, чтобы верхняя грань уступа плитки PR (рис. 32) была направлена параллельно интерференционным полосам в поле зрения микроскопа. Затем движениями микроскопного столика передвигаем рефрактометрический сосуд в направлении перпендикулярном к интерференционным полосам за пределы косого среза и определяем на микрометрической шкале окуляра положение темной нулевой полосы. После произведения отсчета па окулярной шкале, в поле зрения микроскопа вводится косой срез рефрактометрической плитки PR, производится отсчет перемещения d нулевой полосы. Если перемещение нулевой полосы произошло в направлении исследуемой жидкости, то n1 < n и значение ψ вставляем в формулу 28 со знаком "—", наоборот, если полосы перемещаются в направлении рефрактометрической плитки, то n1 > n и значение ψ вставляем в формулу со знаком "+". (В последнем случае нулевая полоса в границах косого среза и за его пределами может быть наблюдаем одновременно в поле зрения микроскопа).

формула n1

Для определенного и постоянного положения призмы W1 в направлении её вертикального движения и для определенной рефрактометрической плитки, выражения 1 / (r tg a) (в формуле 28) и λ/h' (в формуле 15) постоянны и, следовательно, формулу 28 можно представить в виде: n1 = n±K•d  (28а), где К является постоянной величиной, которую можно легко определить путем измерения отклонения интерференционных полос для какой-нибудь жидкости с известным коэффициентом преломления n1, при определенном и постоянном (лучше всего максимально верхнем или нижнем) положении призмы W1. Для получения большей точности можно применить две или три эталонные жидкости. Более практичным является представить эталонирование микроскопа (определение постоянной К) в виде диаграммы, откладывая на одной из осей прямоугольной системы координат значения коэффициента преломления двух или трех жидкостей, примененных для эталонирования, а на второй соответствующие им величины перемещения пулевой полосы в пространстве косого среза рефрактометрической плитки. Этой диаграммой, как это видно из формулы 28а, является прямая линия, пересекающая ось коэффициентов преломления в точке n отвечающей величине коэффициента преломления примененной рефрактрометрической плитки.

В некоторых случаях, когда коэффициент дисперсии исследуемой жидкости определенно отличается от коэффициента дисперсии рефрактометрической плитки, отклоненная темная нулевая интерференционная полоса может иметь окраску, делающую затруднительной её идентификацию.

При таком явлении, для точного определения, какая отклоненная полоса отвечает неотклонепной нулевой полосе, рефрактрометрический сосуд устанавливается так, чтобы грань косого среза была направлена под прямым углом к интерференционным полосам, а затем поворачиваем медленно столик и наблюдаем, какая из перемещающихся в пространстве косого среза полос соединяется с темной нулевой неотклоненной полосой в пространстве, находящемся за пределами косого среза.

Таким образом можно легко безошибочно произвести идентификацию отклоненной пулевой полосы, что является очень важным преимуществом этого метода.

 
← Ранее: Раздел 5. Измерение разности оптического пути. Далее: Раздел 7. Измерение двупреломления
 
© PZO — Polskie Zakłady Optyczne, 1976

Комментарии

Ваши сообщения, дополнения, отзывы, объявления.
Внимание спамерам: все ссылки публикуются через редирект (рефер) и не индексируются!
Ваш ip адрес записан: 54.161.108.158

nikol
91.197.133.202
03-08-2011
куплю
 очень нужен тринокуляр к микроскопу Biolar PI (Польша)
Николай
nickolaid \"собака\" mail`ru
elen
109.108.240.13
13-11-2011
продам
 Новый (в заводской упаковке) биологический микроскоп Biolar 1DP5AZ
elen.d.1@mail.ru
 
  для других приборов - пользуйтесь нашим форумом).
Оставьте Ваши контактные данные здесь:
 
 © 2008-2016, Laboratorium.dp.ua — документация на лабораторное оборудование. © Dr. Andy  
 
 

Авторство

Днепропетровская государственная медицинская академия, кафедра гистологии.
Адрес: 49005, Днепропетровск, ул. Севастопольская, 17 (морфологический корпус ДГМА).
info контактная информация, написать сообщение
Key words: laboratory equipment, microscopy histology, biology.   Ключевые слова: лаборатория, методики, техника, реактивы, описание приборов, инструкции, паспорт, медицина, биология, гистологические исследования, микроскопы.
в каталоге DMOZ! Rambler's Top100