Студенческая научная лаборатория кафедры гистологии ДГМА - Laboratorium - Лабораториум
 home главная · контакты · книги  

Красители / растворители / спирты для любителей (купить)

Фиксация, проводка, заливка, микротомирование, окрашивание, заключение.

Модератор: Andrew

Re: Красители / растворители / спирты для любителей (купить)

Сообщение dennisua » 26 мар 2011, 20:14

Не то, чтобы плохо с реактивами, но тут накладываются несколько факторов. Все магазины находятся далеко и не работают по выходным + продавать хотят ну хотя бы литров пять :)
Последний раз ездил за раствором азур-эозина и ксилола за 26 километров. В обед и час пик - испытание не для слабонервных.
Хмм... а зачем парафин до 200 градусов греть? И воск (коричневая свечка?) обязательно добавлять?
dennisua
 
Сообщения: 38
Зарегистрирован: 11 мар 2011, 15:33

Re: Этиловый эфир, приготовление парафина.

Сообщение admin » 26 мар 2011, 20:58

2Melar: Эфир - ну не то, что бы прекусор, но стоматологи им уже не пользуются, поэтому — не достать; и это был "обмен" с дружественной лабораторией на спирт. А им запретили хранить у себя эфир в таких количествах.

2dennisua: Свежий парафин при застывании образует много воздушных полостей-трещин и крошится при резке; вот "гуру" советских времен и рекомендуют его "проветривать" от примесей нагреванием, а для пластичности — добавлять воск. Некоторый положительный эффект от всего этого наблюдал сам.
Аватара пользователя
admin
Site Admin
 
Сообщения: 99
Зарегистрирован: 15 май 2009, 02:29
Откуда: Днепропетровск

Re: Красители / растворители / спирты для любителей (купить)

Сообщение dennisua » 02 май 2011, 23:32

Всем привет еще раз.
Вернулся из отпуска и восстановил свои эксперименты. Пока изучаю самое доступное - свои "жидкости" и слизистые, а так же все что с них можно соскрести. К сожалению я пока не дождался переходника для подключения фотоаппарата в прямом фокусе, так что снимать приходиться через окуляр - из-за этого качество неважное и показывать особо нечего. Хотя в микроскоп, конечно, видно уйма всего.
В общем решил посмотреть что у меня там живет в гландах. Сделал металлической ложкой соскоб, размазал тонким слоем по стеклу, высушил, провел несколько раз над пламенем спиртовой горелки, залил краской по азур-эозин по романовскому, смыл его через 20 минут. И обнаружил в препарате массу каких-то неведомых мне клеток. Для бактерий они слишком большие, на клетки эпителия тоже не похожи. Что это может быть такое? ВОт как они выглядят на видео.
http://www.youtube.com/watch?v=seyoBl2GINc
Вроде бы как у этих клеток по несколько ядрышек. И таких клеток очень много. На видео это видно, когда я меняю объектив с 40Х на 4Х.

Кстати, еще вопрос. Я для рассматривания препарата капаю капельку глицерина и накрываю покровным стеклышком. Однако на следующий день окраска обычно пропадает. Это из-за глицерина? Канадский бальзам пока не раздобыл.
dennisua
 
Сообщения: 38
Зарегистрирован: 11 мар 2011, 15:33

Re: Красители / растворители / спирты для любителей (купить)

Сообщение admin » 03 май 2011, 02:28

Доброго времени суток, Деннис.
Где-то по истории микроскопии читал (не помню точно формулировку):
"Под микроскопом стали изучать всё, что попадало под руки …", и в следующем абзаце:
"Первым изученным объектом были сперматозоиды человека".
это так, к слову. ;)

По теме — очень хороший мазок для первого раза. Красивые распластанные эпителиоциты и сегментоядерные лейкоциты. Далеко пойдёте, если вовремя не остановят.
Вместо канадского бальзама можете использовать акриловый лак (художники знают).
Для постоянного препарата Вам нужен фиксатор (метанол всё-таки лучше газовой горелки) перед окрашиванием и обезвоживание после него (возрастающая концентрация этанола).
Успехов.
--
С уважением,
Dr. Andy
Аватара пользователя
admin
Site Admin
 
Сообщения: 99
Зарегистрирован: 15 май 2009, 02:29
Откуда: Днепропетровск

Re: Красители / растворители / спирты для любителей (купить)

Сообщение dennisua » 03 май 2011, 12:39

Ой, спасибо на добром слове. Историки микроскопии что-то знали - однозначно :lol:
Но моим первым объектом была слюна. Специально весь день не мыл зубы :? , а вечером посмотрел. Сначала в темном поле смотрел как бактерии крутятся, плавают, дергаются. А потом окрасил по той же методике азур-эозином и прозрел сколько бактерий живет в слюне! Все клетки эпителия (я так понимаю мертвые, так как они окрасились в розовый цвет) были просто усеяны колониями бактерий (синие палочки). Правда после окраски все бактерии выглядели одинаково, а в темном поле я насчитал по крайней мере 4 разновидности.
Надо теперь освоить окраску по граму. Пока буду ковырятся с бактериями и простейшими, так как со срезами тканей пока напряг.
dennisua
 
Сообщения: 38
Зарегистрирован: 11 мар 2011, 15:33

Re: Красители / растворители / спирты для любителей (купить)

Сообщение dennisua » 03 май 2011, 21:07

А ничего не слышали про такой фиксирующий раствор?

BAA fixative: (Boric Acid Alcohol)
50 mL Isopropyl alcohol 70% (aka “rubbing alcohol”)
1 mL Boric Acid solution
50 mL White vinegar
Boric Acid solution: 1 tsp boric acid crystals in 60 mL water
- suggested by Norm Woldow
- submitted by Glenn Shipley

Его рекомендуют использовать в группе Amateur Microscopy на groups.yahoo.com

И еще, можно ли предметные и покровные стекла чистить в ультразвуковой мойке?
dennisua
 
Сообщения: 38
Зарегистрирован: 11 мар 2011, 15:33

Re: Красители / растворители / спирты для любителей

Сообщение admin » 05 май 2011, 21:20

Нет, не слышал.
Ранее с успехом применял кислые фиксаторы, и именно с уксусной кислотой.
В частности, для моих целей очень подошёл "СУФ" — смесь уксусной кислоты, этилового спирта и формалина. Очень похож состав на приведенный вами. В моем случае выигрыш был в сохранности соединительной ткани, — равномерном изменении плотности паренхимы (мышечных клеток) и стромы (коллагеновых волокон, сосудов, прослоек).
А в Вашем случае, если я правильно понимаю, нужна простота методики. Для мазка слюны/крови/ещё-чего-нибудь достаточно высушить мазок и погрузить его на 3-5 минут в р-р метанола (концентрация - см. в справочнике).
Успехов.
--
С уважением,
Dr. Andy
Аватара пользователя
admin
Site Admin
 
Сообщения: 99
Зарегистрирован: 15 май 2009, 02:29
Откуда: Днепропетровск

Re: Красители / растворители / спирты для любителей (купить)

Сообщение labx » 09 май 2011, 00:21

dennisua писал(а):Кстати, еще вопрос. Я для рассматривания препарата капаю капельку глицерина и накрываю покровным стеклышком. Однако на следующий день окраска обычно пропадает. Это из-за глицерина? Канадский бальзам пока не раздобыл.

В практической патоморфологии широко используют синтетическую пластмассу - полистирол. Способ применения этого пластического материала предложен Д. С. Саркисовым и подробно изложен в руководстве Г. А. Меркулова «Курс патолого-гистологической техники» (1969). Полистирол хорошо растворяется в ксилоле и толуоле, прозрачен и быстро затвердевает под предметным стеклом, образуя тончайшую пленку. Mетод растворения тот же, что и для смол растительного происхождения. Однако со временем полистирол становится хрупким, в пленке появляются трещины, что затрудняет микроскопическое исследование и совершенно неприемлемо для микросъемки. Для предотвращения этих недостатков в 30% раствор полистирола в ксилоле добавляют пластификатор, придающий пластичность и гибкость, устраняя все недостатки полистирола. В настоящее время в качестве пластификатора используют дибутилфталат, широко применяемый в электронной микроскопии. Существует несколько вариантов приготовления полистирола для заключения препаратов:

1) 94 мл 30% раствора полистирола в ксилоле смешивают с 6 мл дибутилфталата;

2) смесь, состоящую из 100 г полистирола, 100 мл ксилола и 12 мл дибутилфталата, растворяют при 22°С или в термостате при 37 °С, периодически перемешивая.
Готовую синтетическую смолу хранят в плотно закрытой посуде.

Дибутилфталат продают на строительных рынках с аббревиатурой ДБФ( пластификатор) для ваших целей он с успехом может быть использован.
Аватара пользователя
labx
 
Сообщения: 10
Зарегистрирован: 15 апр 2010, 23:07
Откуда: Москва

Re: Красители / растворители / спирты для любителей (купить)

Сообщение dennisua » 16 май 2011, 11:51

На выходных истыкал свои пальцы иголками в попытках получить достойный мазок крови.
Первая часть, в получении мазка получается довольно удачно. Мазок выходит как на картинках: более плотное начало и "корона" в конце. Но вот с окраской ни как не складывается. Подозреваю что проблема в фиксации.
1. Эксперимент. Окраска по Романовскому (http://vkrovi.ru/gematolog/okraska-po-romanovskomu.html). На высушенный, незафиксированный мазок наношу неразбавленный краситель. Через 2 минуты разбавляю краску дистиллированной водой. Жду двадцать минут. Результат. Белые кровяные тельца окрашены хорошо. Эритроциты скукоженные потрескавшиеся.

2. Эксперимент. Фиксирую мазок крови в этиловом спирте. Окраска по романовскому разбавленным красителем. Результат. Эритроциты видны хорошо, но лейкоцитов в поле зрения нет! Т.е их нет там, где слой эритроцитов в одну клетку. Чуть-чуть слабоокрашенных есть в толще эритроцитов на краю мазка.

3. Эксперимент. Не фиксированные мазки и разбавленная краска. Тут вообще мало чего видно. Эритроциты не окрашены. Лейкоциты есть но видно плохо...

Вопрос! Что я делаю не так! Хотелось бы использовать протокол из п.1
Фотографии этого безобразия есть, приложу позже...

Еще под-вопросик... После того как я приготовил, окрасил и высушил мазок. Можно покровное стеклышко класть сверху на мазок без "промежуточной среды".
dennisua
 
Сообщения: 38
Зарегистрирован: 11 мар 2011, 15:33

Re: Красители / растворители / спирты для любителей (купить)

Сообщение labx » 16 май 2011, 12:04

dennisua писал(а):На выходных истыкал свои пальцы иголками в попытках получить достойный мазок крови.
Первая часть, в получении мазка получается довольно удачно. Мазок выходит как на картинках: более плотное начало и "корона" в конце. Но вот с окраской ни как не складывается. Подозреваю что проблема в фиксации.
1. Эксперимент. Окраска по Романовскому (http://vkrovi.ru/gematolog/okraska-po-romanovskomu.html). На высушенный, незафиксированный мазок наношу неразбавленный краситель. Через 2 минуты разбавляю краску дистиллированной водой. Жду двадцать минут. Результат. Белые кровяные тельца окрашены хорошо. Эритроциты скукоженные потрескавшиеся.

2. Эксперимент. Фиксирую мазок крови в этиловом спирте. Окраска по романовскому разбавленным красителем. Результат. Эритроциты видны хорошо, но лейкоцитов в поле зрения нет! Т.е их нет там, где слой эритроцитов в одну клетку. Чуть-чуть слабоокрашенных есть в толще эритроцитов на краю мазка.

3. Эксперимент. Не фиксированные мазки и разбавленная краска. Тут вообще мало чего видно. Эритроциты не окрашены. Лейкоциты есть но видно плохо...

Вопрос! Что я делаю не так! Хотелось бы использовать протокол из п.1
Фотографии этого безобразия есть, приложу позже...

Еще под-вопросик... После того как я приготовил, окрасил и высушил мазок. Можно покровное стеклышко класть сверху на мазок без "промежуточной среды".


эта методика окраски по Лейшману и то не совсем точная.

Окраска мазков.

Краску следует готовить на воде нейтральной реакции.

Окраска мазков.

Принцип.

Все предложенные методы окраски мазков основаны главным образом на химическом сродстве основных частей клеток к определенным анилиновым краскам и в меньшей степени на их физических свойствах. Цитоплазма одних клеток, будучи щелочной, имеет сродство к кислым краскам, выявляя оксифильные элементы крови. Цитоплазма других клеток, содержащих базофильные и нейтрофильные субстанции, поглощает и кислые, и основные краски. Ядра, содержащие в значительном количестве нуклеиновую кислоту, связывают главным образом основные краски.

К основным гематологическим краскам относятся метиленовый синий и его производные— азур I (метиленазур) и азур II (смесь равных частей азура I и метиленового синего),

к кислым — водорастворимый желтый эозин.

Азур-эозиновые смеси красок обладают высокой чувствительностью к реакции воды и поэтому применяемая для приготовления красителей и для смывания их дистиллированная вода должна иметь нейтральную реакцию, т. е. рН 7,0. При кислей реакции воды клетки долго не прокрашиваются и имеют красный оттенок. При щелочной реакции эритроциты окрашиваются в серовато-синий цвет, а ядра и цитоплазма клеток — в очень темные цвета.

Определение рН воды.

Концентрацию водородных ионов (рН) воды определяют с помощью рН-метра, или индикаторных бумажек.

Нейтрализация дистиллированной воды.

Кислую воду подщелачивают по каплям 1% раствором карбоната натрия,

щелочную — подкисляют 1% раствором уксусной кислоты до тех пор, пока она не будет иметь рН 7,0.

Более удобен способ нейтрализации буферными смесями.

Для этого готовят 1/15 н. растворы:

1) динатрийфосфата (Na2HPO4*2Н20), высушенного в теплом месте в течение 5 сут, растворением 11,876 г его в 1 л дистиллированной воды

2) монофосфата калия (КН2РО4) растворением 9,078 г его в 1 л дистиллированной воды. Эти растворы хранят в темном месте с прибавлением кристаллика тимола для предотвращения образования плесени.

Пользоваться ими можно до образования в них хлопьев.

Рабочую смесь готовят смешиванием 7 частей первого раствора с 3 частями второго.

Пример.

Определяют рН дистиллированной воды, подлежащей нейтрализации. Допустим, что рН воды 5,2, тогда к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 4,5—5 мл указанной выше буферной смеси, перемешивают и вновь определяют рН. Если рН будет 6,8—7,0, т. е. требуемая, то, исходя из этого, высчитывают по простому тройному правилу количество буферного раствора, которое необходимо добавить ко всему количеству дистиллированной воды, подлежащей нейтрализации.

Окраска по Романовскому

Принцип.

Окрашивание различных элементов клеток в разные цвета и оттенки смесью основных (азур II) и кислых (водорастворимый желтый эозин) красок.

Посуда и аппаратура.

1. Колба или бутыль емкостью 1 л.

2. Измерительные цилиндры емкостью 250 мл.

3. Цилиндры для разведения красок емкостью 100 мл.

4. Градуированная пипетка.

5. Штатив для мазков.

6. Кювета со стеклянным мостиком для окраски.

Реактивы.

В продаже имеется готовый раствор краски Романовского, а также сухая краска Романовского (Гимзы), из которой приготовляют раствор следующим образом: 3,8 г сухой краски Романовского растворяют в 250 мл чи­стого метилового или этилового спирта (последний хуже).

Раствор оставляют на 3—5 сут, часто взбалтывая для лучшего растворения краски.

Затем прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3—5 сут, периодически взбалтывая. Приготовленная таким образом краска хорошо сохраняется длительное время в темных бутылях в шкафу, где нет ни кислот, ни щелочей.

Вновь полученный или приготовленный раствор красителя Романовского перед употреблением оттитровывают, т. е. окрашивают несколько фиксированных мазков крови в течение 25—40 мин различно разведенной краской (1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). По хорошо окрашенному препарату устанавливают нужное количество капель краски на 1 мл воды и время окрашивания.

Методика.

Фиксированные мазки укладывают на мостик, состоящий из двух стеклянных палочек, уложенных на два противоположных края кюветы.

Затем мазки заливают разведенной краской, которую наливают на мазок возможно более высоким слоем. Окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха в помещении от 25 до 45 мин.

Если температура в помещении низкая или требуется быстрее окрасить мазки, то разведенную краску можно подогреть до 60—70° (до кипения доводить нельзя).

После окончания окраски краску смывают (но не сливают) сильной струей воды и ставят мазки вертикально в деревянный штатиз для просушивания.

Разведенной краской можно пользоваться только в течение одного дня.

Окраска по Романовскому в модификации Филипсона.

Принцип.

Применение красителей-фиксаторов, которыми мазки крови в первый период одновременно фиксируются и частично окрашиваются, а во второй период, после разбавления красителей -фиксаторов дистиллированной водой, докрашиваются окончательно.

Посуда и аппаратура — см. «Окраска по Романовскому».

Реактивы.

1.Одну часть готовой краски Романовского и 3 части этилового спирта (ректификата) тщательно смешивают. Краска сразу же пригодна к употреблению, но можно готовить ее и заранее.

2. Дистиллированная вода нейтральной реакции.

Методика.

Приготовленный краситель наливают на нефиксированный мазок, покрывая его полностью и

через 1 — 1мин30 сек, не сливая красителя, прибавляют к нему но каплям примерно столько же дистиллированной воды, следя за тем, чтобы вода при соединении с красителем не сливалась с мазка. Через 20—30 мин краситель смывают водой и мазок высушивают.

Этим способом клетки окрашиваются хорошо, но иногда, по-видимому, от недоброкачественности спирта в эритроцитах обнаруживаются мелкие пузырьки, мешающие определению степени насыщения их гемоглобином.

Окраска по Лейшману.

Способ Лейшмана отличается от предыдущего лишь применяемым красителем и продолжительностью периодов фиксации и окраски. При этом способе применяют краситель, получаемый растворением смеси азура I, метиленового синего и желтого водорастворимого эозина в количестве 0,2 г в 10 мл абсолютного метилового спирта.

Продолжительность фиксации неразбавленным красителем 3—4 мин, а окраски с равным количеством воды 5—10 мин.

Способы быстрой окраски мазков краской Романовского по Алексееву.

Принцип.

Одновременная фиксация и окраска мазков с применением для ускорения окрашивания по первому способу подогрева дистиллированной воды и по второму способу — подогрева разведенной краски Романовского.

Посуда и аппаратура.

1. Глазные пипетки.

2. Водяная баня.

3. Темная бутыль с притертой пробкой емкостью 1 л. Остальное — см. «Окраска по Романовскому».

Реактивы.

1. Разведенная краска Романовского (1,5 капли краски на 1 мл дистиллированной воды).

2. Краситель Лейшмана для второго метода (растворяют 4 г сухой краски в 1 л метилового спирта и хранят в темной посуде).

3. Чистый метиловый спирт.

4. Нейтральная дистиллированная вода.

5. Фильтровальная бумага.

Методика.

1. На сухой нефиксированный мазок наносят глазной пипеткой 6—10 капель краски Романовского, распределяя ее той же пипеткой равномерным слоем. Через 30 с другой пипеткой добавляют к краске по каплям удвоенное количество подогретой до 50—60° дистиллированной воды. Покачиванием препарата перемешивают краску с водой и оставляют на 3 мин в покое, затем смывают ее дистиллированной водой и высушивают мазок фильтровальной бумагой. При этом методе окраски частично гемолизируются эритроциты, однако клетки белой крови не изменяются.

При втором способе, приводимом ниже, результаты получаются лучшей окраска препаратов мало отличается от обычной окраски по Романовскому.

2. На сукой нефиксированный мазок наливают равномерным слоем 10—12 ка­пель краски Лейшмана. Через 20—30 с, не сливая краску, добавляют к ней нагретый до 50—60° раствор краски Романовского в количестве, способном удержаться на препарате. Через 3 мин, не сливая краску, смывают ее сильной струей дистиллированной воды и высушивают препарат фильтровальной бумагой.

Окраска по Нохту.

Принцип.

Воздействие на фиксированный мазок водного раствора смеси основной (азур II) и кислой краски (эозин).

Посуда и аппаратура —

см. «Окраска по Романовскому».

Реактивы.

1. Раствор 1 г азура II в 1 л дистиллированной воды.

2. Раствор 1 г водорастворимого желтого эозина в 1 л дистиллированной воды.

Каждый из этих растворов хорошо перемешивают и оставляют созревать при ежедневном встряхивании на 10—14 дней.

Перед окрашиванием раствор красителя готовят смешиванием 25 мл раствора 1,

20 мл раствора 2 с 55 мл нейтральной дистиллированной воды (пропорции вновь приготовленных растворов иногда приходится подбирать эмпирически).

Методика.

Краситель наливают на фиксированный мазок, и окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха 25—45 мин. Затем краситель смывают и мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Паппенгейму — Крюкову.

Принцип.

Комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая—Грюнвальда и краской Романовского, дающая возможность очень хорошо дифференцировать составные части клеток.

Посуда и аппаратура — см. «Окраска по Романовскому».

Реактивы

1. Готовый краситель-фиксатор Мая—Грюнвальда, состоящий из эозин метиленового синего в метиловом спирте.

2. Свежеприготовленный раствор краски Романовского

(1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды).

3. Нейтральная дистиллированная вода.

При отсутствии готового красителя-фиксатора Мая-Грюнвальда его можно приготовить растворением 0,3-0,5 г сухой краски Мая-Грюнвальда в 100 мл чистого метилового спирта с добавлением (или без него) 50 мл чистого глицерина.

Краситель в обоих случаях созревает 4 дня при комнатной температуре.

Методика.

На нефиксированный мазок наливают пипеткой 10—15 капель готового красителя-фиксатора Мая—Грюнвальда, через 3 мин прибавляют по каплям столько же воды и продолжают окрашивание еще 1 мин, после чего краситель смывают водой и мазок высушивают на воздухе.

Затем на высушенный мазок наливают свежеприготовленный водный раствор красителя Романовского на 8—15 мин в зависимости от температуры в помещении, смывают краску водой и мазок высушивают на воздухе. Этот способ окраски является наилучшим.

Окраска по Райту.

Принцип.

Применение специально приготовленного красителя-фиксатора, дающего наиболее четкую окраску зернистости гранулоцитов особенно базофилов.

Посуда и аппаратура.

1. Стеклянные колбы емкостью 250 и 1000 мл.

2. Аппарат Коха.

3. Воронки.

4. Измерительный цилиндр емкостью 500 мл.

5. Штатив для мазков.

6. Мостик для окраски с кюветой.

Реактивы.

Краситель-фиксатор: 1% раствор медицинского метиленового синего на 0,5% водном растворе двууглекислого натрия наливают в сосуд так, чтобы высота слоя не превышала 6 см, и нагревают в аппарате Коха при 100° в течение часа с момента образования пара. Затем жидкость охлаждают и фильтруют. Фильтрат при искусственном освещении в тонком слое должен иметь пурпурно-красный оттенок.

К 100 мл фильтрата прибавляют 500 мл 0,1% водного раствора эозина (желтого, водорастворимого). При смешении обеих жидкостей тотчас же образуется обильный осадок, который отфильтровывают и высушивают. Полученный краситель растворяют в чистом метиловом спирте в соотношении 0,1 : 60.

Методика.

На сухой нефиксированный мазок наливают несколько капель краски, спустя 1 мин прибавляют столько же капель дистиллированной воды. Через 2—3 мин препарат промывают в воде (около полминуты), пока он в тонком слое не приобретает розового оттенка.
Аватара пользователя
labx
 
Сообщения: 10
Зарегистрирован: 15 апр 2010, 23:07
Откуда: Москва

Пред.След.

Вернуться в Гистологические методики

 © 2009-2015, Laboratorium.dp.ua - лабораторное оборудование. © Dr. Andy  
 
 
Авторство: Днепропетровская государственная медицинская академия, кафедра гистологии.
Адрес: 49005, Днепропетровск, ул.Севастопольская, 17 (морфологический корпус ДГМА).
[ home контактная информация, оставить сообщение ]
Rambler's Top100