Студенческая научная лаборатория кафедры гистологии ДГМА - Laboratorium - Лабораториум
 home главная · контакты · книги  

Железный гематоксилин по Гейденгайну и Вейгерту

Фиксация, проводка, заливка, микротомирование, окрашивание, заключение.

Модератор: Andrew

Железный гематоксилин по Гейденгайну и Вейгерту

Сообщение admin » 23 фев 2010, 17:06

Окрашивание гематоксилином
Цитируется: Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс; [пер. с немец. В.Александрова]. – М.: Издательство иностранной литературы, 1953. – 718 с. (с.161-164)

ЖЕЛЕЗНЫЕ ГЕМАТОКСИЛИНЫ ДЛЯ ОКРАСКИ ЯДЕР И ПРОТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ СТРУКТУР
671. В то время, как приведенные выше гематоксилиновые растворы при правильном применении давали главным образом чистую окраску хроматина, нижеследующие растворы гематоксилина окрашивают еще и многие другие составные части тканей.
672. Окраска железным гематоксилином по М. Гейденгайну (1892, 1894, 1896, 1917). При этом ценном необычайно многостороннем методе ткани сперва протравляют в растворе железных квасцов; в зависимости от свойств тканей они воспринимают квасцы с различной интенсивностью. При последующем действии гематоксилинового раствора образуется черный железно-гематеиновый лак, который при следующей за этим экстракцией в разной степени удерживается отдельными элементами тканей.
Приготовление растворов.
а. Раствор железных квасцов. Без нагревания растворяют 10г светло-фиолетовых кристаллов железных квасцов в 100 см3 дестиллированной воды. Этот основной раствор для употребления разбавляют в различной степени (см. ниже). Желтые, выветрившиеся кристаллы не годятся (синонимы железных квасцов: железноаммиачные квасцы, сернокислый окисно-железный аммиак, ферриаммиачный сульфат).
б. Раствор гематоксилина. 0,5 г гематоксилина растворяют в 10 см3 96-градусного спирта и разбавляют 90 см3 дестиллированной воды. Раствор должен 4—5 недель созревать при доступе воздуха. Перед употреблением его разбавляют равным количеством дестиллированной воды. После окраски раствор профильтровывают и повторно употребляют; со временем он становится даже лучше.
Если в запасе нет зрелого раствора, то с помощью NaJO3 можно вызвать искусственное созревание по 651 (на 0,5 г гематоксилина точно 0,1 г NaJO3).
Проведение окраски.
а. Предварительная обработка. Срезы поступают из дестиллированной воды в 2,5-процентный раствор железных квасцов, который приготовляют из основного раствора, разводя его дестиллированной водой, 3—12 час.
или дольше.
б. Окраска. После основательного ополаскивания в дестиллированной воде срезы поступают в разбавленный раствор гематоксилина, 1—36 час.
в. Дифференцировка. Срезы помещают в раствор железных квасцов, служивший для предварительной обработки, в котором черные, как смола, срезы очень, скоро отдают много краски. Время от времени степень дифференцировки контролируют (если нужно, под водной иммерсией), предварительно споласкивая срезы в большом количестве обычной воды, чтобы прервать дифференцировку. Чем дальше продвигается дифференцировка, тем чаще нужно ее контролировать. В известных условиях перед концом процесса его замедляют, употребляя сильно разведенный раствор железных квасцов (например, 0,5-процентный). Когда достигнута надлежащая степень окраски, срезы хорошо промывают в проточной или часто сменяемой воде в течение 15-60 мин.
Результат: учитываемые при дифференцировке структуры (хроматин, ядрышки, клеточные гранулы, митохондрии, центросомы, определенные части поперечнополосатой мускулатуры и др.) выступают исключительно четко и красиво, но во избежание ложных заключений требуется тщательный анализ, так как при этом методе могут сходно окраситься самые разнообразные вещества.
При последующей обработке препаратов, окрашенных железным гематоксилином, нужно избегать эфирных масел, так как они повреждают окраску.

673. Для выявления тончайших плотно лежащих структур целесообразнее пользоваться срезами толщиной 3—5 мкм. Для обзорных препаратов, напротив, можно употреблять срезы толщиной 10—15 мкм. Так как белок сильно подкрашивается железным гематоксилином, то лучше всего наклеивать срезы водой. Во всяком случае, нужно наносить при наклейке очень тонкий слой белка.
Для окраски железным гематоксилином целлоидиновых срезов их лучше всего наклеить, а целлоидин растворить (см. 557), так как он сильно подкрашивается и даже при длительной дифференцировке удерживает довольно темный коричневый тон. Растворять целлоидин нужно до протравы в железных квасцах, так как иначе он становится трудно растворимым.
Выявление отдельных структур можно до известной степени облегчить предварительной обработкой препарата. Так, например, окраска центросом удается легче, если срезы (лучше всего фиксированные в растворах, содержащих сулему) перед окраской железным гематоксилином предварительно окрасить 0,1-процентным раствором бордо R. После такой окраски в дальнейшем цитоплазма и ядра дифференцируются быстрее, чем центросомы.
674. Железным гематоксилином можно окрашивать также и прогрессивно. Для этого предварительно протравленные препараты держат в гематоксилине лишь до тех пор, пока не будет достигнута желательная окраска. Затем основательная промывка в простой воде; спирт, ксилол, бальзам.
675. На материале, фиксированном осмием, почернение, обусловленное осмиевой кислотой, в известных условиях может помешать окраске железным гематоксилином. В этом случае рекомендуется до протравы железными квасцами отбеливать препараты (см. 983 или 1013).
676. От дополнительной окраски препаратов, окрашенных железным гематоксилином, во многих случаях приходится отказаться, так как фон обычно и так уже несколько подкрашен и при дополнительной подкраске четкость препаратов часто снижается. Если все же желательна более сильная подкраска цитоплазматических структур, волокнистых структур и т. п., то препараты, окрашенные железным гематоксилином, можно после промывки перенести еще на 5—10 мин. или более в 0,1-процентный водный раствор рубина S (кислотного фуксина, оранжевого G, светового зеленого и т. п.). Затем споласкивают в 50-градусном спирте и т. д. Очень четкая стойкая подкраска, особенно волокнистых структур (соединительная ткань, базальная мембрана), получается на срезах, протравленных железными квасцами (!) при употреблении бензо-светового бордо. Для этого 1 г красителя растворяют в 100 см3 96-градусного спирта (Гейденгайн, 1926).

677. Окраска ядер железным гематоксилином Вейгерта.
Раствор а: 1 г гематоксилина в 100 см3 96-градусного спирта.
Раствор б: 4 см3 раствора полуторахлористого железа, 1 см3 аптечной соляной кислоты, 95 см3 дестиллированной воды (или 1,16 г хлористого железа, 98 см3 дестиллированной воды и 1 см3 аптечной соляной кислоты). Непосредственно перед употреблением смешивают равные количества растворов а и б. Указанные растворы можно хранить годами, тогда как смесь портится приблизительно через 8 дней. Поэтому всегда смешивают лишь небольшие количества (5—10 см3), которые лучше всего держать в капельнице (см. 623).
Препараты, взятые из дестиллированной воды, кладут для окраски горизонтально и покрывают несколькими каплями раствора красителя. Через 1—2 мин. промывают в проточной воде. При надлежащем сроке окраски дифференцировка не нужна; при перекраске дифференцируют в 0,1-процентной соляной кислоте. После этого очень тщательно промывают.
Железный гематоксилин Вейгерта оказывается крайне полезным для многих целей. Он не только просто, быстро и устойчиво окрашивает ядра, но дает также отличные результаты во многих случаях, когда другие гематоксилины отказывают. Так я обнаружил, что срезы из декальцинированного материала, плохо или вовсе не окрашивающиеся гемалауном, отлично окрашиваются железным гематоксилином Вейгерта. Дальнейшее преимущество этой окраски состоит в том, что целлоидин остается почти совсем не окрашенным или при кратком помещении в 0,1-процентную соляную кислоту полностью обесцвечивается. Железный гематоксилин Вейгерта с успехом может быть применен и на желатиновых замороженных срезах, так как оставляет желатину неокрашенной.
678. Раствор полуторахлористого железа представляет собой 29-процентный раствор хлористого железа.
679. Для приготовления аптечной соляной кислоты к 100 см3 соляной кислоты с уд. весом 1,19 ( = 23° Боме, около 37%) прибавляют 50 см3 дестиллированной воды. Она имеет уд. вес. 1,124 и содержит 25% HCl.
680. 1н—соляная кислота является 3,6-процентной. Для ее приготовления 10 см3 соляной кислоты с уд. весом 1,19 доливают дестиллированной водой до 100 см3.


681. Железный триоксигематеин по Ганзену (1895) дает хорошую стойкую ядерную окраску при довольно умеренной подкраске цитоплазматиче-ских структур. Поэтому этот раствор в известных случаях превосходит простой железный гематоксилин; так, например, мышцы и соединительная ткань при окраске по 672 после фиксации формалином часто окрашиваются пятнами, тогда как при употреблении железного триоксигематеина они оказываются совершенно неокрашенными, окраска же ядер остается.
Приготовление растворов.
Раствор а: в 150 см3 дестиллированной воды при легком, нагревании растворяют 10 г фиолетовых кристаллов железных квасцов и 1,40 г сульфата аммония.
Раствор б: 1,6 г гематоксилина растворяют при нагревании в 75 см3 дестиллированной воды. После охлаждения обоих растворов раствор а при постоянном помешивании вливают в фарфоровую чашку, содержащую раствор б (не наоборот!); смесь делается сначала коричневой, затем синей и, наконец, темнофиолетовой. Смесь медленно нагревают до кипения и кипятят 30—60 сек. (не более!),' при этом лишь слегка помешивают, чтобы не слишком усилить окисление воздухом. Затем быстро охлаждают, пуская чашку плавать в холодной воде.
Готовый раствор должен иметь темнокоричвевый цвет. Зеленоватый тон указывает на слишком сильное окисление. В этом случае раствор окрашивает хуже. Раствор, фильтруя, помещают в бутылку из иенского стекла и хорошо закрывают резиновой пробкой. Размер бутылки подбирают так, чтобы над жидкостью оставалось немного воздуха. После окраски каждый раз сливают обратно.
Для окраски парафиновые или целлоидиновые срезы поступают из дестиллированной воды в фильтрованный раствор красителя, в котором их держат 1—2—5— 10 мин. до достижения желательной степени окраски. Затем— ополаскивание дестиллированной водой и 15-30-минутная промывка
в обычной воде. Далее ополаскивание дестиллированной водой, спиртовый ряд, ксилол, бальзам.
Результат: черно-коричневая четкая окраска ядер. В зависимости от срока окраски и дифференцировки (в 2—3-процентной серной кислоте или 0,5—1-процентной уксусной кислоте) можно выявить также и самые различные клеточные структуры (зернистость, склеивающие полоски, реснички, волокнистые структуры и т. д.).
Если требуется подавить подкраску цитоплазмы и получить чистую ядерную окраску, то к 8 см3 раствора красителя прибавляют 2—4 см3 -процентной серной кислоты.
О дополнительной окраске пикрофуксином по Ганзену см. 709.
---
С уважением,
Dr. Andy
Аватара пользователя
admin
Site Admin
 
Сообщения: 99
Зарегистрирован: 15 май 2009, 02:29
Откуда: Днепропетровск

Окраска железным гематоксилином по Гейденгайну

Сообщение admin » 25 фев 2010, 11:13

1. Срезы из воду поместить в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов (ЖАК) на 10 при 37 С (в термостат), раствор можно нагреть предварительно.
2. Дважды промыть в дист. воде по 2 мин.
3. Перенести в раствор гематоксилина при 37 С (нагреть предварительно) на время, достаточное для почернения до цвета смолы (обычно достаточно 10 мин).
4. Промыть в 2-х порциях дист. воды
5. Дифференцировать в 2,5 % растворе ЖАК (можно разбавить, если срезы быстро терят краску). Время дифференцировки подбирается при каждом окрашивании (в среднем 1-5 мин).
6. Промыть в дист. воде 3 раза по 5 мин.
7. Провести через спирты, ксилол, бальзам.

Растворы:
1. Гематоксилин Гейденгайна:
500 мг гематоксилина растворить в 10 мл 96% спирта и довести дист. водой до 200 мл, прибавить 100 мг NaJO3 и оставить на 1 ч. При комнатной температуре хранится долго.
2. 8 г железоаммонийных квасцов растворить в 200 мл воды.
Аватара пользователя
admin
Site Admin
 
Сообщения: 99
Зарегистрирован: 15 май 2009, 02:29
Откуда: Днепропетровск


Вернуться в Гистологические методики

 © 2009-2015, Laboratorium.dp.ua - лабораторное оборудование. © Dr. Andy  
 
 
Авторство: Днепропетровская государственная медицинская академия, кафедра гистологии.
Адрес: 49005, Днепропетровск, ул.Севастопольская, 17 (морфологический корпус ДГМА).
[ home контактная информация, оставить сообщение ]
Rambler's Top100