Окрашивание гематоксилином и эозином

[admin]

Данная методика очень стара, цитируется - Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс; [пер. с немец. В.Александрова]. – М.: Издательство иностранной литературы, 1953. – 718 с. (с. 156-159).
ОКРАСКА С ГЕМАТОКСИЛИНОМ
646. Гематоксилин, введенный в микротехнику Вальдейером (1882), положил начало разработке ценнейших методов окраски. Этот краситель получается посредством эфирной вытяжки из кампешевого дерева; он представляет собой бесцветные кристаллы, растворимые в воде, глицерине и спирте.
647. Красящие растворы, приготовленные из гематоксилина, приобретают свою способность к окрашиванию обычно лишь через некоторое время: они должны «созреть». Под «созреванием» понимают превращение гематоксилина в гематеин, которое происходит в результате окисления гематоксилина путем отдачи 2 атомов водорода. Таким образом, гематеин, большей частью в соединении с глиноземом, и является собственно действующим веществом при окраске (П. Майер, 1915 и ранее).
Прибавляя к гематоксилину сильные окислители, например йодистый калий, перекись водорода или марганцевокислый калий, можно значительно ускорить процесс окисления, который без этого требует нескольких недель.
При дальнейшем, окислении из гематеина образуются высшие степени окисления, так называемые оксигематеины, которые, наконец, переходят в грязнокоричневые малоценные продукты.
648. Гематоксилин представляет собой краситель, имеющий лишь слабый отрицательный заряд. При переходе в продукты окисления, гематеин и оксигематеин, отрицательный заряд возрастает. Изоэлектрическая точка гематеина лежит при рН 6,5. При образовании лака под влиянием таких электролитов, как железные или калийные квасцы, происходит сильная положительная перезарядка красителя. Железные и квасцовые лаки, имеющие сильный положительный заряд, красят прогрессивно, как основные каменноугольные красители. Подробности см. Секи (1933b).
649. Гематеин имеется в продаже в виде Hämateinum cristallisatum. В прежние годы, когда техника искусственного созревания была еще слабо развита, гематеин был очень употребителен, так как приготовляемые из него растворы можно сразу использовать.
Недостаток его состоит в том, что имеющиеся в продаже препараты неоднородны; наряду с малоокисленными препаратами, растворы которых нуждаются в последующем дозревании, попадаются иногда и слишком сильно окисленные, которые приводят к преждевременному перезреванию растворов. Поэтому следует предпочесть рекомендуемое П. Майером искусственное созревание гематоксилинового раствора при помощи NaIO3, так как при этом всегда получается однородный раствор.

КВАСЦОВЫЕ ГЕМАТОКСИЛИНЫ
650. Из многочисленных красящих растворов, приготовляемых из гематоксилина, в дальнейшем будут приведены лишь важнейшие и наиболее употребительные (литературу о гематоксилине см. П. Майера и Роста, 1904). Особенно рекомендуется кислый гемалаун по П. Майеру и кислый раствор гематоксилина по Эрлиху (1886).
Для разбавления растворов, приготовляемых с квасцами, нужно употреблять лишь 2-процентный раствор квасцов или дестиллированную воду. Другие гематоксилиновые растворы разбавляют дестиллированной водой.
651. Вполне можно рекомендовать начинающим предложенный П. Майером превосходный кислый гемалаун. Он может быть использован сразу после приготовления, дает чистую интенсивно синюю окраску ядер и к тому же первое время не легко перекрашивает.
Приготовление: 1 г гематоксилина растворяют в 1000 см3, дестиллированной воды, прибавляют 0,2 г иодноватокислого натрия (NaJO3, только не NaJ!) и 50 г химически чистых калийных квасцов. Обе соли растворяют при многократном помешивании; при этом раствор принимает фиолетово-синюю окраску. Затем добавляют к раствору 50г хлоралгидрата и 1г кристаллической лимонной кислоты; после чего раствор становится фиолетово-красным. Красящий раствор при хранении в хорошо закрытом сосуде из иенского стекла может долго оставаться годным для употребления.
Срезы поступают из дестиллированной воды на 4—6 мин. в краску, пока не окрасятся хорошо ядра (контролировать). Затем промывка (минимум 10 мин.) в часто сменяемой или проточной обычной воде, после этого темно-синий тон проявляется с полной интенсивностью.
Результат: ядра яркосиние, хрящ темносиний, остальные ткани или не окрашены, или слабо серо-синие.
После кислого гемалауна нужно обращать особое внимание на основательную, тщательную промывку препаратов, так как неудаленные остатки кислоты. вредны для окраски.
Более старые, слишком быстро окрашивающие растворы при известных условиях разбавляют 2-процентным раствором калийных квасцов или дестиллированной водой.
Иодноватокислый натрий и йодистый натрий можно различить по их отношению к абсолютному этиловому спирту. Иодноватокислый натрий (NaJO3, Natrium jodicum, иодат натрия) нерастворим в абсолютном этиловом спирте, йодистый натрий (NaJ, Natrium jodatum, иодид натрия) растворяется в абсолютном этиловом спирте почти до 40%.
652. Кислый гемалаун вполне применим и для окраски целых кусочков. В этом случае окрашивают 24—48 час, затем промывают дестиллированной водой и, наконец, простой водой (всего 24—48 час).
653. Гемалаун дает превосходную чистую ядерную окраску и по старой прописи П. Майера (1891, 1892). Благодаря простоте приготовления и хорошей хранимости он особенно рекомендуется для целей преподавания. Приготовление: при слабом нагревании (не перегреть!) растворяют 1 г гема-теина в 50 см3 96-градусного спирта; растворяют 50 г калийных квасцов. в 1 л дестиллированной воды. Оба раствора сливают, фильтруют и прибавляют тимол. Срок окраски 5—10 мин., затем, как обычно, промывка в обычной воде.
654. Гемалаун иногда выпускают в форме готового к употреблению порошка. 10 г порошка растворяют в 200 см3 горячей дестиллированной воды и, остудив, фильтруют.
655. Лучше всего окрашивать гемалауном прогрессивно (см. 604), так как при перекраске гемалауном или другими растворами гематоксилина простая промывка в воде не помогает. Поэтому время от времени состояние окраски нужно контролировать; для этого срез вынимают из краски, споласкивают в обычной воде и рассматривают под микроскопом. Если желаемая интенсивность окраски достигнута, то ее прерывают. В противном случае, срез возвращают обратно в краску.
656. Перекраску можно устранить, помещая препарат в слабую кислоту (например, в 0,? -процентную соляную кислоту). Тогда срезы становятся красноватыми и теряют окраску. По достижении надлежащей степени окраски нужно очень тщательно промыть их в обычной воде, так как даже малейшие оставшиеся следы кислоты постепенно разрушают окраску. Целесообразно после этого перенести срезы еще в 70-градусный спирт, к которому прибавлено немного бикарбоната натрия или аммиака (около 0,1%). Лучше же всего просто избегать перекраски.
657. При желании получить совершенно чистую ядерную окраску срезы после окраски переносят на короткий срок в 0,1—1-процентный раствор квасцов и затем тщательно промывают в проточной воде. Квасцовый раствор используют и при исправлении перекраски.
658. Гвоздичное, бергамотное и скипидарное масла вредно влияют на сохранность окраски гемалауном и поэтому их следует избегать при последующей обработке препарата.
659. Двойная окраска гемалаун—эозином. Очень часто ядерную окраску гемалауном соединяют с дополнительной окраской (окраска цитоплазмы) эозином или эритрозином (обычно в 0,1-процентном водном растворе; см. также 660). Для проведения окраски препараты, окрашенные кислым гемалауном по 651, основательно промывают и помещают на 3—5 мин. или больше в раствор красителя. Продолжительность окраски зависит, помимо концентрации раствора красителя, от лучшей или худшей окрашиваемости препарата; последняя, в свою очередь, обусловливается, между прочим, характером фиксации. Так как часть краски при последующей обработке снова вытягивается (в воде и в слабых спиртах больше, чем в сильных), то окрашивать нужно сильнее, чем должен быть окончательный тон. Если срезы достаточно сильно окрашены, то избыток красителя отмывают в воде; затем ряд спиртов, ксилол, бальзам (см. также 823).
Результат: ядра и хрящ — синие, все остальное окрашено в различные градации красного тона. Эритроциты после фиксации в жидкости Ценкера и т.п. оранжево-красные.
Начинающие часто склонны перекрашивать эозином, ошибочно считая, что этим достигается более четкое разделение структур. В действительности, однако, при слишком густой окраске препарат становится грязным и нечетким. Таким образом, нужно избегать слишком сильной окраски и устранять
Избыток красителя посредством достаточно длительного извлечения его водой или 70-градусным спиртом. При дифференцировке составные части тканей отдают эозин с различной скоростью. Дольше всего удерживают краситель эозинофильные гранулы, желточные пластинки, ядрышки и эритроциты. Если кислотный краситель, используемый для дополнительной окраски (например, эозин, оранжевый или другой из названных в 660—665 красителей), воспринимается плохо, то раствор красителя подкисляют слабой уксусной кислотой (не более 1 капли на 100 см3 раствора), так как более сильное подкисление может ослабить окраску гематоксилином. Слабое же подкисление не вредит.
660. Эозин можно получать различных марок (растворимый в спирте; AG extra, растворимый в воде; ВА extra синеватый; желтоватый; иодэозин; эритрозини др.). Обычно его употребляют в 0,1-процентном водном растворе. Я лично чаще всего использую эритрозин в 0,1-процентном растворе; он имеет более яркий красный цвет и желтоватый оттенок в нем меньше, чем во многих эозинах.
Домагк из всех эозинов рекомендует в качестве наиболее светоустойчивого стандартизированный растворимый в спирте эозин (см. 618) в 0,1-процентном водном растворе.
При испытании я обнаружил, что раствор этого красителя после ряда фиксаций красит лишь в том случае, если его немного подкислить по 659.
661. Матис (1937) производит часто применяемую подкраску эозин—оранжевым следующим образом (см. также 726): препарат, интенсивно окрашенный гемалауном, после основательной промывки в воде сперва сильно перекрашивают в крепком растворе эозина и сразу после этого дифференцируют под контролем микроскопа в растворе оранжевого.
Приготовление раствора оранжевого. 10 капель насыщенного водного раствора оранжевого G смешивают с 10 сма 96-градусного спирта. Дифференцировка обычно идет быстро. Окраска применима как к парафиновым, так и целлоидиновым срезам.
662. Очень устойчивы к свету красные подкраски ядерным прочным красным или азофлоксином (Андерс, Домагк, 1933). Эти красители очень рекомендуются не только после квасцовых гематоксилинов, но и после железного гематоксилина.
663. Ядерный прочный красный употребляется для окраски протоплазмы. Растворяют 0,1 г красителя в 100 см3 дестиллированной воды и подкисляют одной каплей ледяной уксусной кислоты. Продолжительность окраски обычно 5—10 мин. Затем промывка в воде, ряд спиртов и т. д.
664. Азофлоксин употребляют в 0,05-процентном водном растворе. Перед использованием слабо подкисляют ледяной уксусной кислотой (1 капля на 100 см3 раствора красителя). Продолжительность окраски 5—10 мин., затем вода, ряд спиртов и т.д. Окраска азофлоксином по сравнению с ядерным прочным красным дает красный цвет с более желтоватым оттенком.
665. К старым красителям для дополнительных окрасок после гемалауна и, особенно, после железного гематоксилина относятся кислотный фуксин (фуксин S); рубин S, оранжевый G, световой зеленый. Обычно употребляются 0,5—1-процентные водные растворы или растворы, приготовленные по 614; последние хорошо сохраняются. Перекраска легко выправляется отмывкой в воде. Хорошие результаты дает также хромотроп 2R, который употребляется в, спиртовом растворе (0,1г в 100 см3 96-градусного спирта +1 капля ледяной уксусной кислоты). Эти двойные окраски сохраняются очень хорошо.
---
C уважением,
Dr. Andy

[admin]

1. Депарафинирование, доведение до воды.
2. В гематоксилин Майера на 5 мин.
3. Промыть в проточной (водопроводной) воде не менее 10 мин, периодически меняя воду.
4. Окраска эозином 1 мин.
5. Промыть в дист. воде до 5 мин.
6. Обсушить фильтровальной бумагой вокруг среза.
7. Обезвоживание в спиртах:
96° (№1) только окунуть - 15 сек
96° (№2) 15 -30 сек
100° (№1) 30 сек - 1 мин
100° (№2) 30 сек - 1 мин
8. Ксилол, бальзам.

Примечания:
при перекраске гематоксилином - 70°спирт (20 мл) + HCl (1 капля) - на 1 мин;
при перекраске эозином - слабые спирты.

Гематоксилин Майера
1г гематоксилина р-ть в 1л дист. воды,
добавить 0,2г NaJO3,
добавить 50г алюмокалиевых квасцов.
После растворения добавить 50г хлоралгидрата (CCl3CH(OH)2) и 1г лимонной к-ты.